亞細胞定位
亞細胞定位技術服務
亞細胞是生物學中描述比完整細胞更微觀的結構層級，包括細胞膜、細胞核、細胞質、以及諸如線粒體、葉綠體、內質網、高爾基體、溶酶體、液泡等細胞器。蛋白質必須處于合適的亞細胞位置才能發揮其功能，了解蛋白質的亞細胞定位對于揭示它們的功能、參與的生物學過程以及與其他分子的相互作用至關重要。
亞細胞定位研究可先對氨基酸序列進行生物信息學預測，再結合熒光標記技術、免疫熒光標記及Xenium空間分析等方法，是揭示分子功能、細胞活動機制的核心手段。
浦芥生物提供的亞細胞定位技術服務先對目標蛋白進行生物信息學預測，再將熒光蛋白（如GFP、YFP、RFP等）與目標蛋白融合表達，通過瞬時轉化技術或者遺傳轉化技術，使得融合蛋白在受體材料細胞內表達，目標蛋白會牽引熒光蛋白一起定位到目標細胞器，利用激光掃描共聚焦顯微鏡（Laser Scanning Confocal Microscope, LSCM, 以下簡稱激光共聚焦顯微鏡）觀察熒光蛋白在細胞內顯示的位置，從而確定目標蛋白的亞細胞定位情況。在此基礎上，浦芥生物提供多種共定位服務，轉入一個Marker載體，可以明確目標蛋白具體的定位信息，相比于普通亞細胞定位，共定位得到的結果更加準確。
我們的技術優勢
? 高精度成像系統：共聚焦顯微鏡 + 超分辨率成像（分辨率達0.1μm），無需額外的標記或處理步驟，實驗結果更加直觀和易于理解。
? 多標記兼容性：支持4通道同步標記（如EGFP/mEmerald(超強綠色熒光)/EYFP/CFP/ RFP/mCherry/DAPI等）
? 高表達量的亞細胞定位啟動子及配套的不同強度熒光蛋白，這使得即使目標蛋白在細胞內的表達量較低，也能夠被清晰地觀察到。
? 高侵染能力的農桿菌突變體，增加瞬時蛋白表達量
? 高效表達異源蛋白的煙草及擬南芥突變體；可以在活細胞中進行實時觀察，避免了因處理過程對細胞造成的損傷和改變。
? 實驗經驗豐富：專注于植物細胞樣本分析
實驗流程
服務內容
服務說明
1. 浦芥免費為客戶提供亞細胞定位預測服務，常用預測軟件Cell-PLoc及TargetP - 2.0。
軟件鏈接： http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/
https://services.healthtech.dtu.dk/services/TargetP-2.0/
Reference:
Kuo-Chen Chou and Hong-Bin Shen, "Cell-PLoc: A package of web-servers for predicting subcellular localization of proteins in various organisms", Nature Protocols, 2008, 3, 153-162.
José Juan Almagro Armenteros, Marco Salvatore, Ole Winther, Olof Emanuelsson, Gunnar von Heijne, Arne Elofsson, and Henrik Nielsen. Life Science Alliance 2 (5), e201900429. doi:10.26508/lsa.201900429 (Open access)
2. 浦芥建立的豐富的亞細胞定位載體資源，包含了基于綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、黃色熒光蛋白、青色熒光蛋白的亞細胞定位載體庫，方便選擇使用。亞細胞定位載體選擇參見 《浦芥生物亞細胞定位可用載體列表》。
浦芥生物亞細胞定位可用載體列表
3. 浦芥具有各類細胞器定位的Marker載體，包括細胞核、細胞膜、葉綠體、液泡膜、內質網、高爾基體、自噬小體、過氧化酶體、線粒體等，部分Marker還有多種熒光蛋白，以方便共定位時選擇。共定位可用的細胞器Marker參見 《浦芥生物共定位可用的細胞器Marker列表》。
浦芥生物共定位可用的細胞器Marker列表
4. 為保證煙草轉化效率，本公司不接受客戶提供的農桿菌。客戶如有特殊檢測要求，雙方協商具體服務事項。亞細胞定位技術服務內容包括：亞細胞定位預測、基因克隆、載體構建與驗證、農桿菌轉化、侵染、共聚焦顯微鏡觀察拍照。各項目可整體檢測也可單獨檢測。
5. 收費方式：后付費，零預收費啟動項目。亞細胞定位和共定位有熒光信號就收費，沒有熒光信號不收費。待項目完成數據交與客戶認可后，30日內開具發票，轉賬付費。
6. 結果確認。客戶收到本公司的結題報告后，請務必在7日內確認結果，如有問題及時反饋售后人員，到期如無異議，默認該項目成功。
7. 本合作僅限于為科研單位或個人提供亞細胞定位技術服務，所交付的產物僅作為實驗室的研究材料使用，不具備商業用途，合作雙方應在國家相關法律法規允許的范圍內使用，違者對產生的后果自行負責，本公司不承擔任何連帶責任。
客戶提供材料
1. 目的基因序列，名稱等注釋信息，如果特別要求請在備注中注明；
2. 如客戶需提供質粒，質粒濃度為>100ng/μl，熒光蛋白的顏色或者激發光和發射光波長等信息；
3. 盡可能詳細的填寫“亞細胞定位服務登記表”，發送至售前銷售的微信 15301627726 或郵箱 s[email protected]；
反饋客戶結果
1. 客戶委托本公司構建載體，項目結束后提供構建好的載體及相關測序結果。
2. 激光共聚焦顯微鏡觀察拍照。每個載體提供三組圖片數據，每組數據包括熒光亞細胞定位圖，DIC圖和Merge圖；如果是亞細胞共定位，每組數據包括熒光亞細胞定位圖，細胞器Marker熒光定位圖，DIC圖和Merge圖。
3. 提供包含詳細實驗步驟、分析整理圖片結果的結題報告，以及亞細胞定位的原始圖片。《亞細胞定位技術服務結題報告-模板》【注：此模板僅供參考】
案例展示
【備注：內質網在細胞質內側廣泛分布，是一個連續的膜系統，從核膜一直延伸到細胞膜，廣泛分布，結構較為分散。高爾基體分布在細胞核膜附近，是由膜囊堆疊形成的較為集中的結構，膜比較有規律，數量較少。但植物細胞由于中央大液泡的影響，會將細胞內的成分推擠到更靠近細胞膜的地方，因此有些高爾基體和內質網定位的蛋白觀察到有點類似于細胞膜、細胞核的定位。如果要具體確認定位，則需要做高爾基體，內質網的共定位。】
常見問題及解析（Q&A）
Q：構建亞細胞定位載體時，目標蛋白連在熒光蛋白的N端更好，還是C端更好？
A: 大部分文獻一般都是把目標蛋白連在N端，GFP放在C端；如果目標蛋白連在C端，在加工過程中有可能信號肽 會連同GFP一起被切掉 ，導致熒光淬滅，或熒光信號弱。也有少部分目標蛋白必須連在C端才有信號。極少的目標蛋白需要連入GFP中間才有信號。融合在熒光蛋白N端的目標蛋白一般無法得到過氧化物酶體的定位結果，融合在熒光蛋白C端的目標蛋白一般無法得到線粒體、質體的定位結果。選擇融合位置時需考慮蛋白質的性質和功能，有時可能需要嘗試兩種方式以確定最佳融合位點。
Q：為什么亞細胞定位實驗結果和預期不符？
A: 不同物種或品種的植物細胞在翻譯表達基因時，其表達模式和影響因子不同。建議實驗時盡可能選用與目的基因來源相近的受體材料進行表達。不同時間點取樣拍照，定位位置不同。活體細胞狀態下，某些蛋白有信號肽，會移動。部分蛋白在特定條件（如缺氧）下會發生亞細胞定位改變，需查閱文獻確認正常定位。GFP等標記物融合位置（N端/C端）可能改變定位結果，需根據蛋白序列調整融合策略。有些預期不符的情況可能是由?儀器分辨率限制的，低分辨率儀器可能無法區分相鄰亞細胞結構（如內質網與細胞膜）；?熒光波長與儀器不匹配會導致信號檢測偏差，需更換標記物或調整儀器設置。建議優先排查實驗操作問題，若仍無法解決則需考慮蛋白自身特性或物種差異。查閱數據庫信息或者參考文獻，明確靶蛋白的定位情況，設置空白對照。
Q：為什么不同的受體材料有時得到的定位結果不一樣？
A: 不同物種或品種的植物細胞在翻譯表達基因時，其表達模式和影響因子不同。受物種差異的影響，同一個載體在不同的受體材料中表達的位置可能不同。建議實驗時盡可能選用與目的基因來源相近的受體材料進行表達。
Q：已知一個基因，其翻譯的蛋白很可能是分泌蛋白，用煙草做亞細胞定位的話，后期需不需要做質壁分離處理？如果需要，應該怎么做？
A: 當目標蛋白為分泌肽或含信號肽結構，預測定位于細胞外基質時，可先做初步定位，觀察其是否存在胞質彌散或細胞邊緣聚集的定位情況，也可對分泌蛋白進行監測?，分別在侵染后24h、48h、72h取樣，觀察熒光從內質網→高爾基體→囊泡的動態遷移?。如有，可追加質壁分離驗證；對于明確為胞內細胞器定位的蛋白則無需質壁分離。
?質壁分離的最佳處理時間?是在熒光蛋白充分表達后（農桿菌注射后48-72小時）進行，過早處理易因蛋白表達不足導致信號微弱。
?【操作流程】：① ?葉片處理?：切取表達熒光融合蛋白的煙草葉片（約1cm2）。② 浸入 ?0.5–0.8 M蔗糖溶液?（高滲液）中，避光孵育10-15分鐘。③? 顯微觀察?：將葉片置于載玻片上，加蓋玻片輕壓，激光共聚焦顯微鏡下觀察。?原生質體與細胞壁分離形成空隙表明質壁分離成功。?④ 定位判定熒光信號位于空隙處（質外體），或附著于收縮的原生質體（膜結合）。
【注意事項】：① 質壁分離會破壞細胞膜完整性并改變蛋白分布環境，而分泌蛋白的定位需在活細胞或接近生理狀態下觀察，以保持其動態分泌過程的真實性。實驗處理不當會導致細胞破裂或死亡，熒光信號彌散。因此?蔗糖濃度需要優化，蔗糖處理時間嚴格控制在10-15分鐘。② 滲透脅迫可誘導蛋白錯誤定位（如應激蛋白向膜遷移）?，應該進行關鍵對照實驗設計，觀察排除。③ 為避免細胞邊緣聚集的蛋白被誤判為膜定位，可通過細胞收縮后觀察熒光是否隨細胞膜移動來區分，也可與膜定位marker共定位。?同時也要連續掃描同一細胞區域（間隔5-10分鐘），確認信號無彌散或偏移，從而對定位穩定性進行驗證。?
Q：為什么要提供GFP空載的對照圖片？
A: 作為整個實驗過程中的操作參照，可排除因實驗操作而導致目的基因沒有熒光信號的影響。作為載體體系的參照，確認構建載體時所使用的載體是可正常表達熒光蛋白的。
Q：GFP是細胞全局定位，如果連入基因后跟GFP定位一樣，是否這種定位無意義？
A: 這種定位只能說和GFP一樣，但為了說明蛋白某種功能，必須在需要行使功能的細胞器里有定位；如果全局都有，證明起碼這個蛋白是能行使功能的，GFP一般不影響蛋白的亞細胞定位。
Q：拍攝時為什么有明場通道？
A: 顯示細胞狀態，有活力的細胞應該有正確且明顯的細胞形態，變形或破碎的細胞說明此時細胞不是最適狀態或細胞已死亡。顯示熒光確實是細胞內蛋白表達的，而不是細胞碎片及雜質產生的雜光。
Q：如何解釋蛋白質在多個亞細胞結構中定位？
A: 蛋白質可能在不同條件下或發育階段中具有不同的功能，因此可能存在于多個亞細胞結構中。這可能需要通過進一步的實驗，如條件變化下的重復實驗或使用特定抑制劑，來驗證蛋白質的動態定位。
Q：熒光信號弱或不穩定，如何改善？
A: 優化蛋白表達啟動子，增加翻譯增強子，或添加高效的5`UTR（對部分蛋白，可提高蛋白表達量），或嘗試不同的轉錄終止子。優化煙草培養條件，確保培養條件穩定，避免光照和溫度的劇烈變化；提高侵染農桿菌的濃度。
Q：如何避免熒光淬滅？
A: 使用抗光漂白的熒光蛋白變體，如EGFP，以及在實驗過程中盡量減少光照時間，使用低功率光源，可以減少熒光淬滅。
Q：對基因做定位預測后，是否可以直接做共定位？
A: 不同的預測網站有不同的計算方法，同一個基因在不同的預測網站也可能得出不同的定位結果。另外所有的結果都應是基于實驗得到的，對于不清楚可能定位在哪里的基因，一般推薦先做普通定位，根據普通定位的結果再決定做哪種細胞器的共定位。
Q：共定位系數假陽性什么原因？
A: 通道串色或過曝。嚴格設置單標對照，降低激光功率或增益。
Q：細胞死亡或形態異常是什么原因？
A: 侵染操作不當或熒光蛋白過表達。應減少質粒用量，降低農桿菌濃度，嚴格按照侵染步驟操作。
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